Rabu, 17 Oktober 2012

menghitung mikroorganisme dengan teknik angka lempeng total

Laporan Kegiatan Praktikum ke-5
MENGHITUNG MIKROORGANISME DENGAN TEKNIK
ANGKA LEMPENG TOTAL





Nama : Anggi Novia Anggraini Harahap
NPM   : 2011210016
Kelas  : B
Kelompok      : 1
Tanggal Praktikum  : 7 Oktober 2012


Laboraturium Mikrobiologi Fakultas farmasi Universitas Pancasila
Jakarta, 2012
BAB I
PENDAHULUAN

I.1     Latar Belakang
Seorang farmasis sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya. Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa. Keputusan ini adalah sangat penting. Mempelajari teknik perhitungan bakteri sangat penting agar kita dapat menghitung jumlah bakteri pada berbagai media, seperti sungai yang tercemar, makanan, minuman dll.
Bakteri merupakan mikro uniseluler. Pada umumnya bakteri tidak mempunyai klorofil. Ada beberapa yang fotosintetik dan reproduksi aseksualnya secara pembelahan. Bakteri tersebar luas di alam, di dalam tanah, di atmosfer, di dalam endapan-endapan lumpur, di dalam lumpur laut, dalam air, pada sumber air panas, di daerah antartika, dalam tubuh manusia, hewan, dan tanaman. Jumlah bakteri tergantung pada keadaan sekitar. Misalnya, jumlah bakteri di dalam tanah tergantung jenis dan tingkat kesuburan tanah 
Pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu.
Fardiaz menyatakan ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan. Cara tersebut dibedakan atas beberapa kelompok yaitu: perhitungan jumlah sel, terdiri dari hitungan mikroskopik,  hitungan cawan, MPN (Most Probable Number); perhitungan massa sel secara langsung, terdiri dari volumetrik, gravimetrik, kekeruhan (turbidimetri); perhitungan massa sel secara tidak langsung, terdiri dari analisis komponen sel, analisis produk katabolisme, dan analisis konsumsi nutrien. Sedangkan menurut Irianto (2007), ada beberapa cara penghitungan jumlah mikroba yaitu cara penghitungan pada lempeng pembiakan, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukur kekeruhan, metode turbidimetri dan nefelometri serta dengan jumlah perkiraan terdekat (JPT). Cara penghitungan pada lempeng pembiakan disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni. Pada penghitungan koloni, dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volume pengenceran yang digunakan.



I.2     Tujuan Praktikum
1.    Mengetahui teknik-teknik menghitung bakteri yang umum dilakukan dalam praktek mikrobiologi.
2.    Melakukan teknik-teknik menghitung bakteri untuk menentukan koloni bakteri dalam suatu biakan atau sampel.
3.    Melakukan teknik seri pengenceran agar lempeng/angka lempeng total untuk menghitung jumlah mikroba variabel
I.3     Manfaat Praktikum
Setelah melakukan menghitung mikroorganisme dengan teknik Angka Lempeng Total, mahasiswa diharapkan mampu melakukan teknik-teknik perhitungan bakteri untuk menentukan jumlah koloni bakteri dalam suatu biakan atau sampel, melakukan teknik seri pengenceran agar lempeng untuk menghitung jumlah mikroba viabel. Diharapkan mahasiswa dapat memeriksa pencemaran air sungai, makanan dan minuman yang terkontaminasi sehingga dapat membantu masyarakat.



BAB II
STUDI PUSTAKA
Hasil dari metode hitungan cawan menggunakan suatu standar yang disebut dengan Standart Plate Counts (SPC). Standar tersebut adalah cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumllah koloni antara 30-300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar yang jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni, dan satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (Waluyo 2007). Plate count agar (PCA) adalah mikrobiologi medium pertumbuhan umum digunakan untuk menilai atau memonitor "total" atau layak pertumbuhan bakteri dari sampel. PCA adalah bukan media selektif. Komposisi agar-agar pelat menghitung dapat bervariasi, tetapi biasanya mengandung (b/v) yaitu 0,5% pepton, 0,25% ekstrak ragi, 0,1% glukosa, 1,5% agar-agar, dan pH disesuaikan (Atlas 2004).
Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa semakin tinggi tingkat pengenceran maka jumlah koloni bakteri semakin sedikit. Hal ini dapat dilihat pada pengenceran 10-5 memiliki jumlah koloni yang terbanyak dan pengenceran 10-7 memiliki jumlah koloni paling sedikit dan tidak memenuhi SPC. Jumlah koloni yang berkurang seiring dengan peningkatan pengenceran disebabkan karena jumlah bakteri yang terkandung dalam tiap 0,1 mL volume inokulan yang dipindahkan semakin berkurang akibat pengenceran yang dilakukan.
Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka:
·         Kesalahan statistik tinggi.
·         Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan).
·         Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti.
solusi : memperbesar ukuran sampel.

Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka :
·         Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan.
·         Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi.
·         Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni.
Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni
Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan.
Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut.
Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya, dilakukan perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.
Misalnya:
1. Sampel X tidak dapat diperkirakan jumlah densitas selnya, tetapi sepertinya jumlah ml/cawan adalah lebih dari 300. Perlu dilakukan pemplatingan awal dahulu supaya diperoleh tingkat pengenceran yang cocok sehingga menghasilkan 30-300 koloni per cawan. Contohnya, didapatkan 10-4 yang menghasilkan koloni dengan kisaran tersebut, maka selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat mengulanginya dengan tingkat pengenceran yang sama (tanpa sampai pengenceran yang lebih tinggi).

2. Sample X diperkirakan memiliki jumlah mikroba yang sangat sedikit +/-30 koloni/100ml. Perlu dilakukan penentuan sample size yang tepat terlebih dahulu supaya dihasilkan 30-300 koloni per cawan atau paling tidak mendekati. Misal, jika dengan ukuran sampel:
100 ml dihasilkan 10 koloni,
200 ml dihasilkan 22 koloni,
500 ml dihasilkan 49 koloni,

maka sample size yang paling sesuai adalah 500 ml atau lebih. Penentuan sample size ini juga dipengaruhi sifat sampel itu sendiri dan keterbatasan metode yang dipakai. Selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat menganalisa dengan sample size 500 ml atau lebih. Yang dimaksud ‘mendekati’ disini adalah jika misalnya ditemukan data analisa pendahuluan seperti berikut:
50 ml dihasilkan 0 koloni/cawan,
100 ml dihasilkan 1 koloni/cawan,
200 ml dihasilkan 5 koloni/cawan,
400 ml dihasilkan 11 koloni/cawan,
500 ml dihasilkan 16 koloni/cawan,



Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri antara lain:

ü  Plate count –dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate
ü  Membrane filtration

Pemilihan metode yang benar tergantung kepada :
ü  Jenis sampel
ü  Densitas sel (perkiraan dari analisa pendahuluan)
ü  Spesifikasi standar baku / standar lolos uji

Telah diuraikan didepan bahwa sebagai patokan sebaiknya didapatkan 30-300 koloni per cawan dengan alasan utama adalah kesalahan statistik. Kita tidak perlu mengetahui secara dalam mengenai mengapa harus dalam kisaran itu, atau mengapa tidak 100-500 koloni per cawan, dan alasan-alasan berbau statistik lainnya. Namun sebagai microbiologist yang baik, seharusnya mampu memilih metode yang tepat berdasarkan acuan kisaran itu, karena kisaran 30-300 koloni ini digunakan secara internasional.

Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan.
Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama. Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate.


Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk diketahui jumlah mikroorganismenya adalah:
  1. Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volum.
  2. Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat.
  3. Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung, misalnya bermaksud akan menghitung yeast, bakteri, atau bakteri genus tertentu saja.
  4. Menentukan media pertumbuhan yang cocok.
  5. Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, yeast dan molds.
  6. Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika sample yang dianalisa memerlukan referensi tersebut.



BAB III
METODE PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan
a.   Alat
1.    Pipet-pipet volume steril
2.    Labu erlenmeyer
3.    Tabung-tabung reaksi
4.    Rak tabung reaksi
5.    Pembakar bunsen
6.    Cawan Petri steril

b.   Bahan
1.    Suspensi biakan bakteri berumur 24-48 jam dalam Nutrient Broth, atau sampel yang akan di analisa (untuk sampel mula-mula dibuat homogen sampel 10ˉ¹ (25 g atau 25 ml sampel dalam 250 ml LDF)).
2.    Larutan dapar FosFat.
3.    Nutrient agar steril.

III.2   Cara Kerja
1.    Bekerjalah secara aseptik di sekitar nyala api pembakar bunsen.
2.    Tabung yang berisi bakteri di beri nomor 1(10^-4). Kemudian disiapkan 3 tabung steril dan diberi nomor 2 (10^-5)sampai 4(10^-7) . Semua tabung diisi dengan 9 ml air aquadest steril.
3.    Secara aseptik, pindahkan 1 ml suspensi bakteri nomor 1(10^-4ke dalam tabung no 2 (10^-5) homogenkan.
4.    Secara aseptik, pindahkan 1 ml suspensi bakteri dari tabung no 2 (10^-5) ke tabung no 3 (10^-6) homogenkan.
5.    Secara aseptik, pindahkan 1 ml suspensi bakteri dari tabung no 3 (10^-6) ke tabung no 4 (10^-7) homogenkan.
6.    Siapkan 3 cawan petri steril. Beri nomor 1(10^-5)  sampai 3(10^-7).
7.    Dengan pipet sterli, secara aseptik, pindahkan 1 ml pengenceran bakteri (10^-5) dari tabung ke dalam cawan petri yang sesuai konsentrasinya dan sudah di beri label/nama.
8.    Lakukan hal yang sama terhadap konsentrasi (10^-6^-7)
9.    Tuangkan nutrient agar pada masing-masing cawan petri hingga suspensi bakteri tertutup sempurna. Goyangkan cawan petri menirukan angka delapan untuk menghomogenkan bakteri.diamkan hingga memadat.
10.  Inkubasikan cawan dalam inkubator bersuhu 35-37ºC selama 18-24 jam dengan posisi terbalik.
11.  Amati petumbuhan koloni dan hitung jumlah koloni yang tumbuh di masing-masing perbenihan agar lempeng.
Interpretasi Hasil Angka Lempeng Total :
1.    Bila salah satu cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau kurang dari 300 koloni, dihitung jumlah koloni, kemudian dikalikan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap g atau mL contoh.
2.    Jka terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 30-300 ,maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali jumlah koloni rata-ratapada pengenceran bawahnya, maka Angka Lempeng Total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah.
3.    Bila hasil perhitungan pada pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata kedua tingkat pengenceran, maka Angka Lempeng Total di jumlah lalu di bagi dua.
4.    Bila tidak ada satupun koloni dalam cawan maka Angka Lempeng Total adalah dinyatakan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengencer terendah/
5.    Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian d bagi-bagi menjadi beberapa sektor dan di hitung jumlah koloni dari satu sektor. Angka Lempeng Total adalah jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
6.    Jika jumlah koloni rata-rata dari1/8 bagian cawan lebih dari 200, maka Angka Lempeng Total dinyatakan lebih besar dari 200x8 dikalikan faktor pengenceran.
7.    Perhitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng Total hanya ditulis dlam dua angka. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan dibulatkan ke atas bila lebih dari 5.
8.    Jika dijumpai koloni “Spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian dari cawan, maka dicatat sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya.




BAB IV
HASIL dan PEMBAHASAN

IV.1   Hasil perhitungan bakteri dengan angka Lempeng Total

Cawan ke
Pengenceran
Jumlah Koloni
Jumlah mikroba per mL sampel


I
II
III

1
10ˉ
31
32
237
237x10
2
10ˉ
180
12
21
ga masuk range
3
10ˉ
120
2
5
ga masuk range
Jumlah mikroba yang di dapat : 237x10cfu/ml sampel

IV.2   Pembahasan
           
Pada saat perhitungan bakteri yang telah di inkubasi selama 24 jam, terjadi kekacauan pertumbuhan bakteri, dimana semakin encer, bakteri justru makin banyak atau bisa disebut pertumbuhan bakteri dengan konsentrasi adalah berbanding terbalik. Kesalahan yang mungkin terjadi pada saat pengenceran diantaranya alat yang kurang steril, adanya kontaminan, bakteri yang mati akibat suhu yang terlalu tinggi. Pada saat pengamatan, catat pertumbuhan bakteri pada 3 kelompok yang berbeda, ambil angka yang paling mendekati ketentuan. Di dapat jumlah mikroba pada Angka Lempeng Total adalah 237x10 cfu/ml sampel



BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan pengamatan yang dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam, terjadi kesalahan penanaman bakteri yan gmengakibatkan hasil pertumbuhan tidak sesuai dengan ketentuan, di dapat hasil dimana semakin encer konsentrasi, pertumbuhan bakteri justru semakin banyak. Oleh karena itu, di ambil data dari kelompok lain yang berada pada antara 30-300 yaitu 237x10 cfu/ml sampel.





DAFTAR PUSTAKA

  1. Pelczar dan Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Jakarta. Penerbit Atlas, RM. 2004. Buku Pegangan Media Mikrobiologi. Jakarta: CRC Press.
  2. Capuccino,  J.G & Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. USA: The Benjamin/Cummings Publish. Hal 458.

maaf yaah, lampiran foto hasilnya ga bisa di upload:(